主页 > 视界视点 >研究发现干扰细胞内 DNA 修复机制能提升 CRISPR 效率 >

研究发现干扰细胞内 DNA 修复机制能提升 CRISPR 效率

2020-07-27
阅读指数:948
研究发现干扰细胞内 DNA 修复机制能提升 CRISPR 效率

CRISPR-Cas9 系统做为近年来最热门的基因编辑技术,广泛的在学术界被运用于研究中,能够剔除人类细胞株中的特定基因,并以此找出该基因的功能,但这项技术有个美中不足之处,就是它剔除不同基因时的效果有很大的差异。

在 8 月 17 日发表于网路科学期刊 Nature Communications 的研究中,来自美国加州大学柏克莱分校的研究团队找到了新方法,在各种人类细胞中能够提升 CRISPR-Cas9 剔除(knockout)基因的效率至原先的 5 倍,使得基因剔除变得更加容易,并且有机会让突变基因无法运作,藉此做为医疗方法。

科学家不断地透过各种实验技术在生物系统内发现新基因,以及他们所转译出的蛋白质,但真正困难的工作是,找到这些基因以及蛋白质在生物体内或疾病的形成中所扮演的角色。要找出一个基因或蛋白质的生理功能还有角色最好的办法,就是将它从生物体内移除,看生物运作有什幺改变,藉此来抽丝剥茧找出它可能扮演的角色,最后再以其他实验方法验证。

自从 CRISPR 基因编辑技术出现之后,这项技术使得科学家在进行研究时,能用更短的时间就将特定的基因从细胞株中移除。在这个过程中,研究者必须要不断地尝试各种基因编辑工具,找到效果最好且最适合的才方便实验的进行。由于研究中使用的稳定细胞株大多来自癌化的细胞,这些癌化细胞株的每个基因数目,通常会比一般细胞多出两倍以上,使得基因剔除在这些稳定的癌化细胞株上的难度更高,这项技术改良将能大幅提升进行此类研究的效率。而在这项研究中,研究团队所找到的方法能让这个过程简单而快速许多。

这项技术的关键在于将 CRISPR-Cas9 蛋白质和低聚核苷酸(oligonucleotides)一起送入细胞中,这里用的低聚核苷酸是一种短 DNA 序列,不会和人类基因组中任何片段结合,能够干扰细胞内的 DNA 修复机制,使 CRISPR 所进行的基因编辑效率随之提升。

这项研究的首席研究员是身为加州大学柏克莱分校 Innovative Genomics Initiative(IGI)科学长以及分子及细胞生物学兼任助理教授的 Jacob Corn,他表示,在加强了这项技术之后,剔除特定基因变得非常容易,只要将不会和人类基因结合的合成低聚核苷酸送入细胞中,就能够将基因修改的效率提升 5 倍之高,尤其合成的低聚核苷酸成本也不高,这样的技术使得原先难以执行甚至根本无法成功的 CRISPR-Cas9 运用效率大幅提升。

提升 DNA 修复出错的机会

一旦基因编辑效率提升,科学家们在进行需要基因剔除实验的成功率也就随之提升,接着就能使用剔除特定基因的细胞株进行研究,对于基因功能方面的研究有很大的助益。除了在研究技术上的运用,将这项技术用于剔除遗传的基因突变也能有所助益。内科医师推测特定基因的剔除,会使人们更容易患有某些如爱滋等传染性疾病,或者更容易患有自体免疫失调、发炎症状或者神经退化失调。虽然这方面的应用仍有待未来进一步研究,但目前这项改良技术的高效率已经对研究有许多助益。

CRISPR-Cas9 系统中,Cas9 蛋白质所扮演的角色就像一把专门裁切 DNA 的剪刀,并且根据指示在特定的位置进行截切。负责指示 Cas9 截切位置的是一种被称为嚮导 RNA 的短 RNA 片段,大约由 20 个核苷酸分子所组成,这一小段核苷酸序列和截切的目标基因序列互补,能够和目标 DNA 结合,再让 Cas9 蛋白质得以靠近,并将目标基因的双股 DNA 结构剪开。

在进行截切时,细胞内的修复系统将裁切的切口重新补起来,但是细胞内的修复系统并不是每次都能正确的运作,当修复系统出错时,DNA 序列就会出现突变,可能造成对应的基因失去功能,进而剔除基因活性。

自从 CRISPR 技术在 2012 年被来自加州大学柏克莱分校的 Jennifer Doudna 及瑞典于默奥大学的 Emmanuelle Charpentier 发明以来,不同条件下的效率差异一直都困扰着科学家们。有些嚮导 RNA 有很好的效果,能够帮助 Cas9 几乎百分之百的将目标基因剔除;而有些却正好相反,有些嚮导 RNA 剔除基因的效率非常低,甚至连和目标基因结合都有困难。除此之外,在不同细胞株中基因剔除的效率差异很大也是问题之一。

根据 Corn 的推测,Cas9 在某些状况下剔除基因的效率较差或许和 DNA 的修复方式有关。DNA 修复相关的蛋白质在细胞中稳定的表达,能够修正 DNA 上任何断裂或者缺失,避免细胞因为突变而死亡。但 DNA 修复系统在每种细胞中都不尽相同,而细胞中随机的 DNA 序列可能会扰乱修复系统,并影响成功机率,也就是说研究团队必须得要想办法避免细胞内的修复系统作用。

Corn 形容 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在细胞内的作用不断的和细胞本身的 DNA 修复机制竞争,每当 Cas9 在 DNA 上製造一个切口,细胞就会立即把切口补上,Cas9 再切一次,切口又再次被补上。这样不断重複的截切再修复循环,最后通常会因为修复系统终于出现错误,用错误的序列修复切口而造成突变,进而导致基因丧失原先的功能,这样的循环才会停止。而在这项研究中加入低聚核苷酸或许就是因为它能够干扰细胞内 DNA 修复系统的準确度,或者迫使细胞採取较容易出错的修复机制,藉此帮助 Cas9 能够更有效率的进行 DNA 截切。而研究团队的下一个目标,就是想办法提升 DNA 修复出错的机会,提升插入基因序列的效率,使得未来将有缺陷的致病基因能够被修改以正常的基因取代,藉此治疗基因疾病。

相关阅读: